王興群 毛以智 張文磊
遵義職業(yè)技術(shù)學(xué)院動(dòng)科系
遵義市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心

    近年來，豬病混合感染或繼發(fā)感染日趨嚴(yán)重，由于其具有多因性、復(fù)雜性等特點(diǎn)，給豬病的正確快速診斷以及采取科學(xué)有效的防治措施帶來了困難。豬偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒病、大腸桿菌病是嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的疫病，是高度接觸性傳染病，仔豬十分易感，一年四季均可發(fā)生，主要危害出生后幾小時(shí)至斷奶后2周內(nèi)的小豬，尤以初生仔豬多發(fā)，呈地方性流行，一般表現(xiàn)為突然發(fā)生，病勢(shì)急，造成仔豬出現(xiàn)嚴(yán)重?cái)⊙Y、腹瀉和衰竭而死亡，發(fā)病率和死亡率均較高，給地方養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。2012年底～2013年年初，遵義多家養(yǎng)豬場(chǎng)相繼發(fā)生不明原因仔豬疫病，主要表現(xiàn)為仔豬體質(zhì)弱、消瘦、腹瀉，呼吸困難甚至突然死亡，為查明病因，對(duì)發(fā)病豬進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)室診斷，為本次疫情防控明確了方向。

1　試驗(yàn)材料與方法
1. 1　病料
實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的患豬的病料隨機(jī)采集自貴州省遵義市某養(yǎng)豬場(chǎng)。
1. 2　試劑
    胰蛋白胨、酵母粉購(gòu)自O(shè)xiod 公司；藥敏紙片均為購(gòu)買臨床用藥后于實(shí)驗(yàn)室自制；新生小牛血清購(gòu)自貴陽恒因生物有限公司。豬繁殖與呼吸綜合征病毒RT-PCR 檢測(cè)試劑盒（含RNA提取試劑盒）、豬瘟病毒RT-PCR 檢測(cè)試劑盒、豬偽狂犬病毒PCR檢測(cè)試劑盒、豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自世紀(jì)元亨公司。
1. 3　流行病學(xué)調(diào)查
向畜主調(diào)查發(fā)病情況、臨床癥狀，剖檢病豬情況，記錄結(jié)果。
1. 4　細(xì)菌檢測(cè)
    無菌采取病料肝臟、脾臟、心臟劃線接種在鮮血瓊脂平板培養(yǎng)基上，于無氧和有氧兩種條件下，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，并對(duì)純化細(xì)菌繼續(xù)生物實(shí)驗(yàn)鑒定和藥物敏感實(shí)驗(yàn)。
1. 5　C SFV 和PR R SV 的R T-PC R 檢測(cè)
    分別取病死仔豬病變肺組織、淋巴結(jié)、腎臟加適量D EPC水進(jìn)行充分研磨，反復(fù)凍融3次后，按試劑盒說明書提取病料組織總RNA及RT-PCR擴(kuò)增，20 μl  RT-PCR體系如下：16. 8 μl  RT-PCR反應(yīng)液，1. 2 μl 酶混合液，2. 0 μl 模板。反應(yīng)條件：42 ℃、45 m i n；94 ℃、3 m i m ；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延長(zhǎng)7 m i n。擴(kuò)增產(chǎn)物以2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
1.6　豬繁殖與呼吸綜合癥（P R V ）和豬圓環(huán)病毒?、蛐?BR>PC V 2 的PC R 檢測(cè)分別取病死仔豬病腦組織、淋巴結(jié)等研磨，反復(fù)凍融3次后按試劑盒說明書提取病料組織總DNA及PCR擴(kuò)增，20 μl  RT-PCR體系如下：16. 0 μl RT-PCR反應(yīng)液，1. 2 μl酶混合液，2 μl模板。反應(yīng)條件為：42 ℃、45 m i n；94 ℃、3 m i m ；94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延長(zhǎng)7 m i n。擴(kuò)增產(chǎn)物以2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析
2. 1　流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果
該養(yǎng)殖場(chǎng)飼養(yǎng)母豬600頭，公豬15頭，哺乳仔豬1 200頭，保育豬1 100頭，育肥豬1 600～1 700頭，各豬群均發(fā)生腹瀉，其中，以2～3 日齡哺乳仔豬腹瀉嚴(yán)重。剖檢斷奶前仔豬與保育豬可見淋巴結(jié)發(fā)紫出血，腎臟有明顯出血點(diǎn)。
2. 2　細(xì)菌學(xué)檢測(cè)結(jié)果
2.2.1　細(xì)菌分離與鑒定
無菌取送檢病豬材料進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)過夜后，培養(yǎng)基表面長(zhǎng)出灰白色、圓形、光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、微凸起菌落，革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性桿菌。
2.2.2　藥物敏感試驗(yàn)
取上述純化細(xì)菌均勻涂于肉湯培養(yǎng)基上，選擇常見獸用抗生素進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果詳見附表。從藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，分離細(xì)菌對(duì)多種藥物不敏感。建議：首選腸道康（乙酰甲喹）對(duì)病豬群進(jìn)行治療，對(duì)臨床健康豬群進(jìn)行預(yù)防性治療，以控制病情擴(kuò)散。
2. 3　豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征病原核酸檢測(cè)
采集病豬材料經(jīng)試劑盒提取病料總R N A ，分別以豬瘟病毒（CSFV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）RT-PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)上述核酸樣本進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。
2. 4　豬偽狂犬病，豬圓環(huán)病病原核酸檢測(cè)
采集病豬材料經(jīng)試劑盒提取病料總DNA，分別以豬偽狂犬病毒（PRV）和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）PCR檢測(cè)試劑盒對(duì)上述核酸樣本進(jìn)行目的基因擴(kuò)增。

3　討論
    當(dāng)前引起仔豬發(fā)病死亡的原因很多，混合感染導(dǎo)致病情較復(fù)雜，診斷困難，防治效果不理想。由于同時(shí)存在幾種病原混合感染，這些混合感染既有細(xì)菌與細(xì)菌、病毒與病毒、細(xì)菌與病毒，還有傳染病和寄生蟲病或普通病等?；旌细腥就ㄟ^簡(jiǎn)單的流行病學(xué)調(diào)查、臨床剖檢等方法卻很難分辨，必須通過實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)才能確診，主要通過PCR[ 1，2]、RT-PCR[ 3]、RT-LAM P[ 4]、ELISA[ 5]等方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷，必要時(shí)可做動(dòng)物回歸試驗(yàn)[6]。發(fā)生疫情時(shí)及時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷并采取對(duì)應(yīng)的方案，可極大地減少損失。本病例經(jīng)流行病學(xué)調(diào)查，實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)，確診本次疫情應(yīng)為豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型與大腸桿菌混合感染所致。
混合感染病例在我市很多豬場(chǎng)時(shí)有發(fā)生，并且有越來越多的趨勢(shì)，應(yīng)引起我們高度重視?；旌细腥静±仨氝M(jìn)行系統(tǒng)的診斷，及時(shí)找出是由哪些病原共同感染引起。對(duì)于由多種病原混合感染引起的疫病，必須采取綜合防治措施，強(qiáng)化免疫接種并加強(qiáng)飼養(yǎng)管理以及藥物防治等，才能有效控制疫病的流行，減少死亡。
豬圓環(huán)病毒病是嚴(yán)重的免疫抑制性疾病，豬在感染豬圓環(huán)病毒Ⅱ型后，病毒在機(jī)體內(nèi)的各種淋巴細(xì)胞中繁殖、復(fù)制，從而使豬體內(nèi)的T淋巴細(xì)胞和B 淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，導(dǎo)致患豬體況下降，形成免疫抑制，從而導(dǎo)致機(jī)體的免疫力大大下降。細(xì)菌感染后，由于不能科學(xué)的用藥導(dǎo)致耐藥菌株的不斷增多、耐藥譜日益擴(kuò)大。這些疾病的發(fā)生都是相輔相成的，這也提醒我們需要進(jìn)行綜合防控。以高致病性豬繁殖與呼吸綜合征為主的重大疫病危害巨大且廣泛存在，要高度重視其綜合防控，尤其要搞好平時(shí)的免疫。